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恒奧德儀器紫外分光光度計儀器組成 測定方法
點擊次數:1078      更新時間:2023-03-20

恒奧德儀器紫外分光光度計儀器組成 測定方法

 

儀器組成

分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統組成。

光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200400 nm的紫外光區。不同的光源都有其*的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。

分光光度計圖片

分光光度計圖片(4)

鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。

氫燈(或氘燈)的發射光譜:氫燈能發出185400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。

 

蛋白質的直接定量(UV法)

這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,測試空白液,然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在些雜質,般要消除320nm 背景"信息,設定此能"。與測試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,發現讀數漂移"。這是個正常的現象。事實上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不過1%,表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度,乘以定的系數,只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較。

比色法蛋白質定量

蛋白質通常是多種蛋白質的混合物,比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關,從而反應蛋白質濃度。

測定方法

比色方法

般有BCABradfordLowry 等幾種方法。

Lowry 法:以早期的Biuret 反應為基礎,并有所改。蛋白質與Cu2 反應,產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時間較長;容易受到非蛋白物質的影響;含EDTATriton x-100ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。

BCABicinchoninine acid assay)法:這是種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系較強,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應,產生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特點是,敏感度好,是Lowry BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單,速度更快;只需要種反應試劑;化合物可以穩定1小時,方便結果;而且與系列干擾LowryBCA 反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。主要的缺點是不同的標準品會導致同樣品的結果差異較大,無可比性。


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